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酸熱誘導大豆分離蛋白納米顆粒形成及其荷載姜黃素的特性

放大字體  縮小字體 發布日期:2020-08-20
核心提示:隨著人們對膳食營養與健康的日益重視,功能性食品的開發己成為食品領域研究者的關注熱點。姜黃素(Cur)是一種天然來源的疏水性多酚,具有一系列潛在有益的生物和藥理作用,在功能性食品領域發展前景廣闊。
   隨著人們對膳食營養與健康的日益重視,功能性食品的開發己成為食品領域研究者的關注熱點。姜黃素(Cur)是一種天然來源的疏水性多酚,具有一系列潛在有益的生物和藥理作用,在功能性食品領域發展前景廣闊。然而,Cur存在水溶性低、加工穩定性差以及生物利用度低等問題,嚴重制約了產業化應用及人群積極性反饋。與合成聚合物及其他生物大分子相比,蛋白質在生物相容性及環境友好等方面更具優勢。其中通過納米技術制備納米級的蛋白載體還利于發揮Cur的尺度效應。作為現今食品工業生產和利用最廣泛的植物蛋白,大豆蛋白市場可接受度高,且己有研究將其用于β-類胡蘿卜素、香草醛和白藜蘆醇等多種疏水活性物質的荷載。
 
  基于Cur在有機溶劑中的溶解特性,為了提高其包埋率,反溶劑法被廣泛應用。但是反溶劑過程中消耗大量的有機試劑以及純水,不符合現代食品工業環保綠色的生產原則。研究操作簡便且綠色環保的物理方法制備大豆分離蛋白(SPI)-Cur納米顆粒極具工業應用價值。
 
  華南理工大學食品科學與工程學院的袁丹、趙謀明和張思銳等人以SPI為原料,在特定pH值條件下(pH 7.0、5.9)靜態加熱處理(95 ℃、30 min)誘導SPI自組裝形成納米顆粒,分別記作HSPI及HSPI(pH 5.9),系統表征了它們的粒徑、PDI、表面疏水性以及表觀形貌,并利用熒光光譜研究它們與Cur的相互作用。通過均質或超聲處理制備SPI-Cur納米顆粒,探究蛋白-Cur納米顆粒中Cur的水溶解度以及顆粒的性質和貯藏穩定性。
 
  1 SPI納米顆粒的形成與表征
 
  1.1 顆粒粒徑、分散性和表面疏水性
 
  實驗首先利用DLS探究了pH 7.0及pH 5.9條件下加熱對蛋白粒徑及PDI的影響。結果顯示,SPI雖然平均粒徑小(<80 nm),但是粒徑分布不均勻(PDI>0.5)。熱作用使得SPI發生熱變性形成聚集體,顯著增加其平均粒徑,但是同時增加其分散均一性。進一步通過ANS-法測定3 個蛋白樣品的表面疏水性,結果表明,熱處理可顯著增加蛋白表面疏水性(P<0.05)。其中,pH 5.9條件下加熱蛋白可使巰基轉變成二硫鍵,而二硫鍵的周圍常聚集著疏水性氨基酸,這使得HSPI(pH 5.9)的表面疏水性最高。
 
  1.2 形貌學
 
  為了更好地了解SPI納米顆粒以及比較SPI、HSPI和HSPI(pH 5.9)三者的差異,通過TEM觀察其表觀形貌,如圖1所示。SPI表面光滑,大部分為近乎球形顆粒,其顆粒大小不一;HSPI表面粗糙,顆粒感減弱,有明顯的聚集體出現;而HSPI(pH 5.9)均為球形,表面較SPI略粗糙,顆粒大小均一,雖有部分聚集在一起,但仍以單獨的顆粒呈現,表觀粒徑較SPI大;這些結果與DLS測得的結果一致。
 
  而加熱使得肽段伸展并吸附在顆粒的表面,因此HSPI和HSPI(pH 5.9)的表面呈現粗糙狀。得出結論,通過在95 ℃加熱SPI溶液(pH 5.9)30 min誘導了SPI發生自組裝,形成了具有核-殼結構的球形SPI納米顆粒。此外,與DLS測定的平均粒徑相比,TEM的結果普遍偏小,可能與空氣干燥過程及顆粒在干燥過程中的結構收縮有關。
 
  2 SPI與Cur相互作用研究
 
  如圖2A~C所示,在280 nm的激發波長處,SPI、HSPI和HSPI(pH 5.9)都呈現出強熒光強度,其中SPI在334 nm波長處具有最大熒光強度,HSPI和HSPI(pH 5.9)在340 nm波長處具有最大熒光強度。這一現象表明經過熱處理后SPI內源疏水氨基酸所處微環境更加親水。而隨著加入的Cur濃度(0~10 μmol/L)增加,蛋白質的熒光強度逐漸降低,并且最大熒光發射波長發生藍移,表明Cur與蛋白質的疏水性氨基酸發生了結合,使得它們所處的微環境極性降低,說明了Cur與SPI結合的作用力主要是疏水相互作用。
 
  為了更直接的表征兩者結合的親和力,通過Stern-Volmer方程計算Cur對SPI、HSPI和HSPI(pH 5.9)內源熒光的猝滅常數(Ksv)。以F0/F為縱坐標、Cur濃度為橫坐標作圖(圖2D),經線性擬合后發現Cur濃度與SPI、HSPI和HSPI(p H 5.9)三者的F0/F值都呈現出良好的線性關系(R2≥0.99),表明Cur可均勻的結合在蛋白的疏水基團上。計算得到SPI、HSPI和HSPI(pH 5.9)與Cur結合的Ksv值分別為0.274、0.454、0.550 μmol/L,可以發現熱處理SPI的Ksv值相比SPI顯著提高(P<0.05),并且HSPI(pH 5.9)猝滅效果更加顯著,說明HSPI(pH 5.9)與Cur之間具有更高的親和力,這是HSPI(pH 5.9)表面疏水性高賦予蛋白的獨特性質。
 
  Cur的固有熒光對其周圍環境的極性高度敏感,因此,研究了不同SPI、HSPI和HSPI(pH 5.9)濃度下Cur的熒光特性。如圖3所示,沒有SPI的情況下在420 nm波長處激發游離Cur時呈現的熒光峰強度非常低。隨著蛋白質量濃度(0~5 mg/mL)的增加,Cur的最大熒光強度也隨之增加,這表明SPI、HSPI和HSPI(pH 5.9)有效提高了Cur的溶解性。另外,Cur的最大熒光發射波長從長波長向短波長變化,這種熒光峰的藍移表明Cur向極性更小的環境移動。由圖3還可看出,HSPI(pH 5.9)對于Cur熒光強度的提高相比SPI和HSPI更加顯著,該結果與圖2結果一致。綜上,具有核-殼結構的HSPI(pH 5.9)納米顆粒與Cur具有強結合親和力,這主要是歸因于Cur與蛋白質之間的疏水相互作用,這種核-殼結構對于提高Cur溶解性有顯著效果,可用于荷載及遞送Cur的潛在壁材。
 
  3 SPI-Cur納米顆粒的形成與表征
 
  3.1 SPI-Cur中Cur的水溶性及其粒徑和分布
 
  SPI-Cur納米顆粒中Cur的含量是評價其對Cur是否成功包載及增溶的有效依據。將SPI、HSPI和HSPI(pH 5.9)與Cur粉末混合攪拌后經均質或超聲,離心后得到的上清液為黃色、透明狀液體(圖4A),超聲處理對SPI提高Cur水溶性更加有效,說明超聲處理有利于蛋白與Cur之間的結合。
 
  值得關注的是,超聲后HSPI(pH 5.9)可將Cur粉末在水中的溶解量提高至12.43 μg/mL,相比Cur粉末在水中的溶解度11 ng/mL,其溶解度提高了1 130 倍左右。除了HSPI(pH 5.9)蛋白自身表面疏水性高以及超聲的驅動作用影響外,HSPI(pH 5.9)的核-殼結構中大量疏水基團形成的強疏水內核更有利于與Cur的結合也是主要原因(圖5)。
 
  SPI-Cur顆粒的平均粒徑及其分布如圖4B所示,與SPI、HSPI和HSPI(pH 5.9)相比,均質后SPI-Cur、HSPI-Cur和HSPI(pH 5.9)-Cur顆粒粒徑以及PDI大小的變化均不顯著。與均質后樣品顆粒相比,經超聲處理得到的U-SPI-Cur和U-HSPI-Cur顆粒平均粒徑均減小,但PDI值沒有顯著變化。與之不同的是超聲后U-HSPI(pH 5.9)-Cur顆粒粒徑雖略有增加,但分散性卻依舊保持良好。
 
  3.2 蛋白-Cur納米顆粒熒光光譜研究
 
  進一步利用熒光光譜研究蛋白-Cur納米顆粒中蛋白質及Cur結構的變化。從圖6A、B可以發現,經過均質或超聲處理后,SPI、HSPI和HSPI(pH 5.9)的內源熒光最大發射波長均發生了紅移,這可歸因于均質和超聲增加了蛋白的溶解度,使得疏水基團所處環境極性增強。由于Cur與蛋白結合,導致了蛋白內源熒光不同程度的猝滅,說明它們之間主要通過疏水相互作用而結合。此外,由蛋白-Cur納米顆粒中Cur的熒光光譜結果表明超聲處理后熒光強度比均質后更低,超聲顆粒中Cur的最大發射波長紅移,說明超聲可以誘導SPI與Cur共組裝。
 
  圖6C、D對Cur熒光的研究結果表明SPI、HSPI和HSPI(pH 5.9)與Cur作用后,增強了Cur的熒光強度,改善了Cur的溶解性,超聲處理后效果更加顯著。無論是均質還是超聲形成的納米顆粒,都表明了HSPI(pH 5.9)與Cur結合的能力更強,蛋白質熒光猝滅和Cur熒光增強與蛋白-Cur納米顆粒中Cur水溶性提高的結果一致。綜上結果表明,超聲處理可以增強SPI與Cur的相互作用,進而提高Cur的水溶性,HSPI(pH 5.9)的核-殼結構更有利于與Cur在均質和超聲過程中的共組裝形成均一分散性好的納米顆粒。
 
  4 超聲后蛋白-Cur納米顆粒的貯藏穩定性
 
  為了考察蛋白-Cur顆粒(U-SPI-Cur、U-HSPI-Cur和U-HSPI(pH 5.9)-Cur)中Cur以及顆粒本身的貯存穩定性,在25℃貯存30 d進行監測。圖7A顯示,新鮮制備的U-SPI-Cur和U-HSPI-Cur中Cur含量迅速減少,第3天時上清液中Cur的保留率分別僅有50%和60%,隨著貯藏時間的延長,Cur的保留率緩慢降低,而U-HSPI(pH 5.9)-Cur中Cur含量在7 d后才開始逐漸降低。在貯存30 d后,U-HSPI(pH 5.9)-Cur中Cur保留率為77%,遠高于U-SPI-Cur(35%)和U-HSPI-Cur(44%)。從圖7B、C可以看出,貯藏過程中,超聲后形成的蛋白-Cur顆粒粒徑和PDI均保持穩定。上述實驗結果表明,相比SPI和HSPI,HSPI(pH 5.9)的核-殼結構對Cur的保護作用更佳,形成的納米顆粒具有良好的貯藏穩定性。
 
  結    論
 
  本實驗以SPI為原料,在pH 7.0和pH 5.9條件下對其進行靜態熱處理,得到了SPI、HSPI和HSPI(pH 5.9)3 種蛋白顆粒,其中HSPI(pH 5.9)是具有疏水核心和親水殼的核-殼結構,它們均可通過疏水相互作用與Cur結合以提高Cur的水溶性。通過均質或超聲等物理處理可成功制備SPI-Cur納米顆粒,其中超聲處理對于增強蛋白與Cur之間的相互作用更加顯著。HSPI(pH 5.9)的核-殼結構更加有利于蛋白在超聲過程中與Cur發生共組裝,形成粒徑小(<120 nm)、分散均一(PDI<0.2)的U-HSPI(pH 5.9)-Cur納米顆粒,極大提高Cur的水分散性及貯藏穩定性。綜上研究結果表明,HSPI(pH 5.9)可作為潛在的優質納米級壁材用于Cur等疏水活性物質的包埋與輸送。
 
 
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