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乳鐵蛋白對三唑酮誘導骨髓間充質干細胞損傷的修復作用

放大字體  縮小字體 發布日期:2020-08-15
核心提示:三唑酮是一種廣譜抗真菌農藥,它被廣泛應用于多種作物的病害防治。
   三唑酮是一種廣譜抗真菌農藥,它被廣泛應用于多種作物的病害防治。但是該農藥可能在農作物、土壤和水體中殘留,給生物安全與人類健康帶來負面的影響。目前有關三唑酮的研究大多著重于水生生物,對哺乳動物的研究較少,三唑酮對SD大鼠骨髓間充質干細胞(BMSCs)影響的研究鮮見報道。BMSCs作為成骨細胞和脂肪細胞共同的前體細胞,對于維系二者之間的均衡起著至關重要的作用,在維持正常的骨代謝均衡方面也具有十分重要的意義。
 
  已有研究證明乳鐵蛋白(Lf)具有促進成骨細胞增殖的作用,本課題組前期的研究發現Lf及其消化產物都能促進BMSCs向成骨分化。BMSCs是骨重建中新骨形成的主要來源,在三唑酮作用下,BMSCs發生損傷,Lf修復損傷后的BMSCs活性及增殖能力成為關注的熱點之一。
 
  東北農業大學食品學院、乳品科學教育部重點實驗室的謝銀丹、趙添玉和劉寧*等人利用三唑酮作用于骨髓間充質干細胞建立BMSCs損傷模型,研究Lf對三唑酮損傷BMSCs 的修復作用,以期為今后三唑酮殘留對BMSCs定向分化的影響研究提供量化參考,也為Lf的深度開發和調控個體生長發育提供新的理論參考。
 
  1 三唑酮對BMSCs存活率的影響
 
  由圖1可知,與對照組(0 μg/mL)比較,采用不同質量濃度(0.01、0.1、1、5、10、20 μg/mL)的三唑酮處理1 d時,20 μg/mL三唑酮能對BMSCs造成損傷,其余較低質量濃度三唑酮會不同程度促進BMSCs增殖;當處理時間延長至3、5、7 d時,不同質量濃度的三唑酮均能對BMSCs造成顯著損傷,且三唑酮對BMSCs的損傷作用在所選范圍內呈現質量濃度-效應關系和時間-效應關系。根據三唑酮造成的細胞存活率的半數致死量,以及考慮到損傷時間的長短,本研究選取20 μg/mL的三唑酮處理3 d作為構建BMSCs損傷模型的條件,此條件下的細胞存活率為55.41%。
 
  2 Lf對BMSCs增殖的影響
 
  由圖2可知,與對照組(0 μg/mL)比較,采用不同質量濃度的Lf處理BMSCs 1、3、5、7 d,均能不同程度地提高BMSCs的存活率。隨著作用時間的延長,Lf對BMSCs的增殖作用顯著增加,5 d時作用效果最明顯;這說明Lf在10~200 μg/mL范圍內對BMSCs無毒性作用且能促進其增殖,其中100 μg/mL的Lf作用最顯著。
 
  3 Lf對損傷BMSCs存活率的影響
 
  結果顯示,與空白對照組比較,三唑酮損傷處理不同時間后,BMSCs存活率均顯著下降(P<0.05);對損傷模型加入Lf處理不同時間,結果顯示均能顯著提高BMSCs存活率(P<0.05)。
 
  4 Lf對損傷BMSCs成骨分化過程中分泌ALP的影響
 
  結果顯示,與空白對照組相比,三唑酮組誘導處理后,ALP質量濃度顯著降低(P<0.05);Lf組和Lf修復組的ALP質量濃度顯著增加(P<0.05)。由此可知,Lf可有效修復三唑酮對細胞成骨分化造成的損傷。
 
  5 Lf對損傷BMSCs成骨分化過程中分泌OCN的影響
 
  OCN是成骨分化特異性表達的胞外基質蛋白,因OCN僅在成骨細胞內表達,故可以作為特異性指標來評價BMSCs的成骨分化能力。結果顯示,與空白對照組相比,三唑酮組誘導處理后,OCN質量濃度顯著降低(P<0.05);Lf組和Lf修復組的OCN質量濃度顯著增加(P<0.05)。由此可知,三唑酮會對細胞向成骨分化造成一定損傷,而Lf可有效修復這種損傷。
 
  6 Lf對損傷BMSCs成骨誘導21 d后礦化結節形成的影響
 
  由圖4可以看出,與空白對照組相比,三唑酮組細胞形狀仍為長梭形,極少有礦化結節形成,說明三唑酮對BMSCs向成骨分化造成了損傷;Lf組形成的礦化結節最多,說明Lf對BMSCs向成骨方向進行分化具有促進作用;Lf修復組和三唑酮組相比礦化結節數量更多,成骨分化較為明顯,說明Lf可修復三唑酮對BMSCs向成骨分化造成的損傷。
 
  7 Lf對損傷BMSCs成脂誘導21 d后脂滴形成的影響
 
  由圖5可以看出,與空白對照組相比,三唑酮組出現脂滴數量最多,說明三唑酮會使BMSCs向成脂方向進行分化;Lf組脂滴數量最少,這說明Lf能抑制脂滴生成;Lf修復組脂滴數量少于三唑酮組,說明Lf對三唑酮促進BMSCs向成脂分化的進程有拮抗作用。
 
  8 成骨誘導21 d后成骨分化基因的表達
 
  結果顯示,與空白對照組比較,Lf處理后成骨分化中關鍵基因的表達水平都有所提高,Lf組ALP、BMP-2、Osteorix、Col I、Runx2、OCN基因表達分別上調52%、14%、50%、18%、70%、186%;Lf修復組上述基因分別上調28%、3%、50%、14%、17%、52%;三唑酮組上述基因分別下調24%、42%、50%、57%、50%、12%。Lf組成骨分化主要基因的上調比例大于Lf修復組。
 
  9 成脂誘導21 d后成脂分化基因的表達
 
  結果顯示,與空白對照組比較,Lf處理后都下調了成脂分化中關鍵基因的表達水平,Lf組PPAR-gamma、LPL、FABP4基因分別下調23%、26%、10%;Lf修復組上述基因分別下調4%、12%、0.5%;三唑酮組上述基因分別上調8%、25%、21%。
 
  討    論
 
  本研究選擇BMSCs作為細胞模型研究三唑酮對細胞增殖分化損傷及Lf對此損傷的修復作用,選用6 個三唑酮質量濃度梯度(0.01、0.1、1、5、10、20 μg/mL)作用于BMSCs,暴露時間1 d時,最高質量濃度(20 μg/mL)三唑酮能對BMSCs造成損傷,其余較低質量濃度三唑酮會不同程度促進BMSCs增殖;當暴露時間延長至3、5、7 d時,不同質量濃度的三唑酮均能對BMSCs造成顯著的損傷,細胞存活率隨著暴露時間顯著降低,說明三唑酮在所選劑量和時間范圍內可抑制BMSCs增殖活性,對BMSCs具有損傷作用。三唑酮細胞毒性作用隨暴露時間的逐漸增強。
 
  Lf可能對這種損傷具有修復作用,所以選用6 個Lf質量濃度梯度(10、20、50、100、150、200 μg/mL)作用于BMSCs后計算細胞存活率,結果表明,Lf對BMSCs無毒性作用且能促進BMSCs的增殖,其中100 μg/mL的Lf作用最顯著。分析Lf作用于BMSCs損傷模型后的細胞存活率、ALP質量濃度、OCN質量濃度、茜素紅染色、油紅O染色和定向分化基因表達變化,結果表明:三唑酮損傷BMSCs后,細胞存活率顯著降低,細胞ALP、OCN質量濃度顯著降低,礦化結節形成極少,脂滴數量增多,成骨分化相關基因的相對表達顯著降低,成脂分化相關基因的相對表達顯著增加。而100 μg/mL的Lf就能夠提高損傷BMSCs的細胞存活率,增加細胞ALP、OCN水平,增加細胞的礦化結節,減少脂滴的生成,增加成骨分化相關基因的相對表達,減少成脂分化相關基因的相對表達。
 
  綜上所述,Lf能夠促進骨髓間充質干細胞增殖,使BMSCs向成骨方向進行分化,更好地促進新骨形成,也對三唑酮所誘導的骨髓間充質干細胞損傷具有修復。本研究可以為今后三唑酮殘留對BMSCs定向分化的影響提供一定的理論依據,也為Lf調控個體生長發育提供新的理論參考,對于三唑酮在體內的代謝作用機制還有待進一步研究。
 
 
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