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靈芝菌絲體多糖對人皮膚成纖維細胞氧化應激損傷的防護機制

放大字體  縮小字體 發布日期:2020-08-13
核心提示:如今,快節奏的工作生活環境使機體極易處于氧化應激狀態。在正常條件下,機體的酶防御體系發揮著非常重要的作用,超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)等通過清除多余的自由基來減緩氧化損傷。
   如今,快節奏的工作生活環境使機體極易處于氧化應激狀態。在正常條件下,機體的酶防御體系發揮著非常重要的作用,超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)等通過清除多余的自由基來減緩氧化損傷。氧化應激被認為是衰老的早期階段。近年來,人們不斷尋求具有防護氧化應激損傷作用的天然活性成分。靈芝多糖(GLP)是靈芝的重要活性成分之一,已有研究發現GLP在抗氧化功效方面具有出色的表現。高活性GLP的篩選及其機制研究則顯得尤為重要。
 
  除了機體自身抗氧化酶系統發揮防護氧化應激的作用機制外,Kelch樣環氧氯丙烷相關蛋白-1(Keap1)-核因子-E2相關因子(Nrf2)/抗氧化反應元件(ARE)信號通路被認為是機體最重要的內源性抗氧化信號通路。Keap1-Nrf2/ARE途徑表達的蛋白質分子為機體提供了重要的防御作用,是對抗環境有害物質損傷和內源性應激的有力武器。分析該信號通路中重要活性分子的表達水平變化,對于深入分析物質發揮防護氧化應激損傷的內在機制具有非常重要的意義。
 
  鑒于此,北京工商大學理學院、植物資源研究開發北京市重點實驗室的張佳嬋、邵卿和王昌濤*等人以實驗室保存靈芝菌種G055為研究對象,采用常規熱水浸提法對GLP進行工藝條件的優化,并進一步初步純化及分析。同時以H2O2誘導的人皮膚成纖維細胞(HSF)損傷模型為研究載體,分析GLP及其組分對細胞內活性氧(ROS)、丙二醛(MDA)及相關抗氧化酶的作用效果,評價GLP對H2O2誘導的HSF氧化應激的保護及修復功效;最后,以Keap1-Nrf2/ARE信號通路上下游關鍵調控因子為重要考察對象,探究其在mRNA水平的變化。
 
  1 GLP的提取及純化工藝
 
  1.1 GLP的提取工藝優化
 
  固定料液比為1∶50(m/V),浸提溫度為70 ℃,浸提1 次,考察浸提時間對多糖提取率的影響。結果顯示,提取時間為1 h時,GLP提取率最高;提取時間在1.5~2.5 h范圍內,提取率無顯著性差異(P>0.05);當提取時間延長至3 h時,GLP提取率最低。因此,從節約角度出發,選擇1 h作為最優提取時間。
 
  固定料液比為1∶50(m/V),浸提時間為2 h,浸提1 次,考察浸提溫度對GLP提取率的影響,實驗結果顯示,70 ℃時多糖提取率達到最大,且與其他條件相比差異顯著(P<0.05),故確定最佳浸提溫度為70 ℃。
 
  固定浸提時間為2 h,浸提溫度為70 ℃,浸提1 次,考察料液比對GLP提取率的影響,結果顯示,當料液比為1∶30和1∶60(m/V)時,多糖提取率最高,兩者之間無顯著性差異(P>0.05),但與其他條件相比顯著提高了GLP提取率(P<0.05)。考慮原料成本因素,在該條件下的最優單因素提取條件確定為料液比1∶30(m/V)。
 
  固定料液比為1∶50(m/V),浸提時間為2 h,浸提溫度為70 ℃,考察浸提次數對多糖提取率的影響,實驗結果顯示,隨提取次數的增加,多糖提取率大幅下降,第二次提取率僅為(8.05±1.34)%,綜合考慮,選擇浸提次數為1 次。
 
  結果顯示,這3 個因素的最佳組合為A3B1C3。FA=113.29、FB=103.19、FC=68.26,依照影響強度由大到小的順序排列,得到三因素對GLP提取率的影響強弱順序(由強到弱)為A>B>C。在最優提取工藝條件(料液比1∶35,m/V),浸提溫度65 ℃,浸提時間1.5 h下進行驗證,得到GLP提取率為(47.70±0.50)%,相對標準偏差為1.04%,再現性良好。利用該方法提取靈芝菌絲體多糖,其提取率遠高于靈芝子實體。
 
  1.2 GLP的純化工藝
 
  本實驗對GLP進行了8 次去蛋白處理,結果如圖2所示。蛋白的脫除率與處理次數呈正相關,首次處理后脫除率僅為(12.31±0.24)%,第8次可達(72.87±1.90)%。當用Sevag處理6 次后,蛋白質的脫除率變化不明顯。考慮到多糖成分與有機試劑長時間接觸可能會影響其生物活性,因此共進行6 次處理,此時蛋白的脫除率可達(66.68±1.13)%。
 
  用DEAE-52離子交換樹脂對脫蛋白后的GLP進行初步分離純化,得到洗脫曲線。由圖3可知,共4 個洗脫峰(I~IV)分別出現在90、390、690、990 mL處,收集合并各組分。考慮到GLP III和GLP IV吸光度較低,故僅選用第一組分(GLP I)和第二組分(GLP II)進行后續實驗。將收集的組分透析后冷凍干燥,得到GLP I、II。
 
  對GLP及其組分GLP I、GLP II進行衍生反應,利用GC-MS測定單糖組成。圖4為GLP(A)、GLP I(B)、GLP II(C)的GC圖譜。經過與標準品相對分子質量及標準曲線對比,GLP及其組分的單糖組成及物質的量比例結果顯示,其中GLP I較GLP、GLP II多出鼠李糖和巖藻糖兩種單糖,考慮為純化后的富集作用所引起的。
 
  2 GLP對H2O2誘導的氧化應激模型的保護和修復作用
 
  2.1 GLP對氧化損傷細胞脂質過氧化產物積累情況的影響
 
  圖5A、B分別為保護和修復作用下GLP、GLP I、GLP II與VC對HSF細胞內MDA含量影響的結果。結果表明,100 μmol/L H2O2處理細胞2 h處理后Model組能夠極顯著提高細胞內MDA含量(P<0.01)。與Model組相比,GLP、GLP I、GLP II、VC均能極顯著減少HSF細胞內MDA的積累(P<0.01)。在本實驗所考察作用濃度下,各保護作用處理方式中,樣品減少MDA積累的能力由高到低依次為GLP II>VC>GLP>GLP I,修復作用中,樣品降低MDA積累的能力由高到低依次為VC>GLPII>GLP>GLP I,兩種作用中VC與GLP II均不具有顯著性差異(P>0.05)。
 
  2.2 GLP對HSF細胞內ROS水平的影響
 
  保護與修復兩種處理方式下GLP及其組分(GLP I和GLP II)與VC對細胞活性氧水平的影響結果如圖6A、B所示。與Control組相比,H2O2處理后極顯著提高了細胞內ROS水平(P<0.01)。總體上看,兩種作用方式下,GLP、GLP I和GLP II均能極顯著降低HSF細胞內ROS的含量(P<0.01),與陽性對照VC相比,GLPI在保護作用方面具有更為優異的表現。
 
  2.3 GLP對氧化損傷細胞抗氧化酶水平的影響
 
  在保護和修復兩種方式下,GLP、GLPI、GLP II與VC對HSF細胞內CAT活性影響的結果顯示,與Model組相比,兩種作用方式處理下,GLP、GLP I、GLP II、VC均能極顯著提高HSF細胞內CAT的活力(P<0.01);在本實驗所考察作用濃度下,在保護作用處理方式中,各樣品提高CAT的能力由高到低依次為:GLP I>VC>GLP>GLP II,修復作用處理方式中為:GLP I>GLP II>VC>GLP。
 
  在保護和修復兩種方式下,GLP、GLPI、GLP II與VC對HSF細胞內GSH-Px活力影響的結果表明,兩種作用方式處理下,GLP、GLP I、GLP II與VC均能顯著提高HSF細胞內的GSH-Px活力。在保護作用處理方式下,1.25 g/L GLP I處理HSF細胞24 h再進行H2O2損傷處理,其最終的GSH-Px活力達到(12.19±0.61)U/g,比Model組提高了36.84%;在修復作用處理方式下,GLP I組GSH-Px活力為Model組的7.56 倍,且3 種靈芝多糖處理后的GSH-Px水平均高于陽性對照VC。
 
  在保護和修復兩種方式下,GLP、GLPI、GLP II與VC對HSF細胞內SOD活力影響的結果。與Control組相比,Model組細胞內SOD活力顯著降低(P<0.05)。與Model組相比,GLP、GLP I、GLP II和VC均能極顯著提高HSF細胞內SOD活力(P<0.01);并且GLP及其兩組分的促進能力均高于陽性對照VC;GLP I的保護和修復能力最高,保護處理方式下,GLP I組SOD活力為Model組的2.39 倍;修復處理方式下,GLP I組的SOD水平為Model的2.92 倍,具有較好的提高SOD活力的能力。
 
  3 GLP對H2O2誘導的氧化應激模型Keap1-Nrf2/ARE信號通路的影響
 
  由前期實驗可知,GLP、GLP I、GLP II的質量濃度均為1.25 g/L時,其活力均在80%以上,因此設定低(0.5 g/L)、中(1.5 g/L)和高(2.5 g/L)3個劑量來探究GLP對Keap1-Nrf2/ARE信號通路各因子表達水平的影響。圖8為保護作用處理方式下,不同樣品對Keap1-Nrf2/ARE信號通路關鍵信號分子的表達情況影響。由圖8A可知,各靈芝多糖(GLP、GLP I和GLP II)處理后,Nrf2 mRNA表達量均極顯著高于Model組(P<0.01),并且顯著高于陽性對照VC組。由圖8B可知,與Model組相比,負調控因子Keap1的相對表達量變化趨勢并不一致,在GLP低劑量組、GLP中劑量組、GLP I中劑量組、GLPII組高劑量組、GLP II組低劑量組中,Keap1表達受到極顯著抑制(P<0.01),而在其他組中顯著高于Model組;陽性對照VC組的Keap1 mRNA相對表達量與Model組相比差異不顯著(P>0.05)。
 
  在保護作用研究中,除GLP I中劑量組極顯著降低了下游抗氧化因子HO-1的表達量,其他樣品均能極顯著提高HO-1的表達量(P<0.01)(圖8C)。GLP中劑量組、高劑量組的NQO1表達提高,且與Model組相比差異極顯著(P<0.01),GLP I、GLP II組在中劑量組顯著表達(P<0.05,P<0.01)(圖8D)。
 
  圖9 為修復作用處理方式下,不同樣品對Keap1-Nrf2/ARE信號通路關鍵信號分子的表達情況影響。由圖9A可知,在修復作用中,各靈芝多糖組除高劑量組外,Nrf2的表達量均極顯著提高(P<0.01);陽性對照VC修復后,并沒有提高Nrf2的相對表達量。由圖9B可知,負調控因子Keap1在各靈芝多糖處理組中均極顯著低于Model組(P<0.01)。由圖9C可知,GLP I、GLP II組中HO-1的表達量隨質量濃度的增加先降低后升高,而HO-1僅在GLP低劑量組中極顯著表達(P<0.01)。由圖9D可知,GLP高劑量組,GLP I、GLP II中劑量組的NQO1極顯著表達(P<0.01)。
 
  討   論
 
  在本研究中,來源于菌種wG055的靈芝多糖GLP及其組分GLP I和GLP II同樣具有顯著的防護氧化應激損傷的功效。在保護和修復兩種處理方式上,GLP及其組分顯著降低了HSF損傷細胞MDA的積累和ROS水平,與文獻[47]報道相符;并且,GLP可以顯著提高細胞抗氧化酶的水平,對Keap1-Nrf2/ARE關鍵信號因子具有顯著的調節作用,進一步解釋了其發揮防護氧化應激方面的作用機制。
 
  本實驗為GLP在食品、藥品領域的應用提供了一定的理論參考。但是,在機制研究方面可能還不全面,盡管Keap1-Nrf2/ARE信號通路是一條重要的內源性抗氧化信號通路,但是機體的內在平衡是多因子、多信號通路復雜調控的結果。后期可以借助組學技術對GLP的深層機制進行更系統、更全面的分析,闡明GLP發揮作用的深層機制。
 
 
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